颅内动脉瘤在血管内治疗后的愈合依赖于早期血栓进入成熟疤痕组织和新内膜形成的组织。炎症级联的激活和失活在这一过程中起着重要作用。除了及时进化外，其地形分布被认为是动脉瘤成功愈合的关键。
在Lewis大鼠身上制造脱细胞的囊状侧壁动脉瘤，并将其盘绕。随访时(3天后)(n=16);7天(n=19);21天(n=8))，切除动脉瘤并评估其愈合情况。对可溶性炎症标志物(IL6、MMP2、MMP9、TNF-α、FGF23、VEGF)进行原位杂交，并对炎症细胞(CD45、CD3、CD20、CD31、CD163、HLA-DR)进行免疫组化分析。这些标记特别记录了五个感兴趣的区域:动脉瘤颈、穹窿、新生内膜、血栓和邻近血管壁。
螺旋状动脉瘤的血栓组刚过二本线的公办大学织和新内膜形成模式增强，而未经治疗的动脉瘤血栓形成、血栓再通和动脉瘤生长模式不一致(p=0.02)。在盘状动脉瘤中，炎症标志物倾向于在血栓和新生内膜内积聚(p < 0.001)。内皮细胞直接聚集在新生内膜(p < 0.0001)，它们的存在与动脉瘤完全愈合有关。
促炎细胞的存在在动脉瘤盘绕后的重塑中起着至关重要的作用。血栓组织的特点是明显的血栓内炎症反应，而新内膜成熟的特点是内皮细胞的直接侵袭。关于再生炎症过程的地形分布的知识可能为未来的治疗方式铺平道路，从而提高血管内治疗后动脉瘤的愈合。
血管内治疗(EVT)后动脉瘤的愈合依赖于血栓组织和内皮化新生内膜的形成。这一过程主要是由源自邻近血管和动脉瘤壁的肌成纤维细胞系的细胞迁移介导的[1,2]。炎症级联的激活和失活在启动和指导细胞迁移中起着重要作用[3]。由于颅内动脉瘤(IA)的发病机制与壁细胞丢失有关，从而引发慢性动脉瘤壁炎症，情况很复杂[4,5]。此外，惰性的，特别是生物活性的血管内材料(如支架)可能引发长期的局部炎症反应，从而损害生物IA愈合[6,7]。虽然一些局部急性炎症对于启动动脉瘤愈合过程是必要的，但长期和覆盖性炎症可能导致持续的血栓重塑，而没有血栓成熟，导致残留的动脉瘤灌注或进一步的动脉瘤生长[8,9]。最后，在EVT后动脉瘤愈合过程中，促炎细胞因子和细胞类型的存在遵循明显的时间级联[10]。
对于壁高度退化的易发破裂的IAs, EVT后的愈合和永久性闭塞是非常具有挑战性的[9,11]。事实上，人体组织病理学和实验研究都表明，在EVT后的低细胞IAs中，动脉瘤穹窿及其颈部之间的新内膜形成不一致，血栓组织模式也不均匀[4,12]。除了及时进化外，炎症因子的空间-地形分布因此被认为是IA成功愈合的关键。本研究研究了实验性脱细胞大鼠囊状侧壁动脉瘤EVT后炎症和愈合标志物的地形分布，特别是在以下感兴趣区域(roi):动脉380分理科上什么大学瘤颈部、动脉瘤圆顶、血栓内部、新生内膜和邻近血管壁。
本研究共纳入12周龄及以上雄性Lewis大鼠n=52只(法国Janvier实验室，Le Genest-Saint-Isle)。所有动物以4只为一组，在22-24°C的特殊房间中饲养，光照/黑暗循环12小时，无限制地使用颗粒饲料和自来水。他们得到了符合机构指导方针的人道关怀。手术产生侧壁动脉瘤后，将动物随机分为实验组(线圈治疗组)和对照组(自然过程组)，分别随访3天、7天和21天，然后收集组织进行进一步分析(图1)。由于先前使用的模型显示出7天后动脉瘤生长和自发破裂的高发生率，因此出于伦理原因，对照组省略了21天的随访[4]。在卷绕后7天炎症达到高峰，对该组进行了繁殖队列研究(n=4)。先验样本量计算显示理想的群体规模为n=8(附加文件1)。实验得到当地动物福利委员会(BE 60/19)的批准，并按照ARRIVE指南进行[13]。
研究设计流程图。在总共n=52只动物中，n=5只被用作组织供体，n=4只因发病率(n=2，术后截瘫)或过早死亡(n=2: n=1与麻醉相关，n=1不清楚)而被排除。对照组未进行21天随访，因为该模型在这段时间内动脉瘤生长和自发破裂率较高[4]。
将大鼠置于毒气室，吸入4%异氟醚直至失去意识，称重(340±15 g)，注射芬太尼(Sintetica Switzerland) 0.005 mg/kg +美托咪定(Medetor, Virbac，英国)0.15 mg/kg +咪达唑仑(Dormicum, Roche，瑞士)2mg /kg s.c的混合物。术中持续监测重要参数(心率、动脉血氧饱和度、呼吸频率和体温)(MouseOx, Starr Life Sciences Corp.， Oakmont，美国)。1%异氟内蒙古高考报名醚通过氧气面罩维持麻醉。总体而言，n=5只动物被用作组织供体，如前所述，在n=47只动物中形成了囊状侧壁动脉瘤[14]。简而言之，将一段标准的供体动物胸主动脉结扎，在十二烷基硫酸钠(SDS)中进行化学脱细胞处理，并将其端侧缝合至受体动物腹主动脉。在动脉瘤形成手术中，使用2厘米(3毫米直径)的Target 360 TM Ultra线圈(Stryker, Kalamazoo, MI, USA)进行卷取，吻合口的最后象限仍然打开。手术后，通过皮下注射丁丙诺啡(Temgesic，个体，瑞士)0.05 mg/kg +阿替帕唑(Revertor, Virbac，英国)0.75 mg/kg +氟马西尼(Labatec，瑞士)0.2 mg/kg实现麻醉逆转。术后镇痛通过在恢复意识时给予美洛昔康(metacam，勃林格殷格翰，德国)1.5 mg/kg (s.c)，然后在手术后三天神州大学每天两次。手术后1周，在饮用水中添加葡萄糖5% (B.Braun，瑞士)和丁丙诺啡0.3 mg/ml (Temgesic, indivir，瑞士)作为基线辅助物。丁丙诺啡0.05 mg/kg根据需要给予抢救性镇痛。
4只动物因过早死亡(n=2: n=1与麻醉有关，n=1尚不清楚)或发病率(n=2只术后截瘫动物未采集组织的过早安乐死)而被排除在分析之外。其余动物在预先设定的时间点用过量的心内盐酸氯胺酮注射(Narketan, Vetoquinol，瑞士，120 mg/kg)实施安乐死。取动脉瘤，测量各尺寸，打开后主动脉检查动脉瘤口。组织立即用4%多聚甲醛固定，然后包埋在石蜡中(FFPE, J.T. Baker，荷兰阿纳姆)。
石蜡包埋的动脉瘤平行于其下载动脉切成2 μm的薄片。用于染色的标准方案包括苏木精-伊红(HE)， Masson-Goldner三色(MASA)，以及平滑肌肌动蛋白(SMA)和血管性血友病因子(fviii)的免疫染色。
通过Bond RX (Leica Biosystems)和RNAscope?技术(Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA)的自动染色，进行原位杂交(ISH)检测mRNA。所有载玻片在Bond Dewax Solution(产品代码AR9222, Leica Biosystems)中脱蜡，在Tris Buffer(产品代码AR9640, Leica Biosystems)中pH为9时热诱导表位检索，在95°下保存15分钟，蛋白酶处理5分钟。使用以下RNAscope 2.5 LS探针(Advanced Cell Diagnostics):大鼠特异性探针靶向成纤维细胞生长因子23 (FGF23, NM_130754.1)、基质金属肽酶2 (MMP2, NM_031054.2)、MMP9 (NM_031055.1)、白细胞介素6 (IL6, NM_012589.2)、肿瘤坏死因子(TNF, NM_012675.3)和血管内皮生长因子A (VEGFA, NM_031836.2) mRNA。所有探针在37°下孵育120分钟。采用Leica BOND RX-BROWN (Advanced Cell Diagnostics)上的RNAscope?2.5 LS Assay作为预扩增系统。随后，使用3,3-二氨基联苯胺(DAB)作为棕色显色剂(Bond polymer refine detection, Leica Biosystems, Ref DS9800)将反应可视化20分钟。最后，样品用haematoxylin反染20分钟，脱水，用Pertex (Sakura)贴装。
将2.5 μm的FFPE切片固定在载玻片上，干燥，并在60°C下烘烤30分钟，进行免疫组化评价。Bond RX (Leica Biosystems)免疫染色仪用于自动染色。所有载玻片在Bond脱蜡溶液中脱蜡(产品代码AR9222, Leica Biosystems)。抗原提取采用Tris-EDTA缓冲液(代码AR9640, Leica Biosystems)，在95°温度下提取30 min，用于抗cd3 (1:400, Thermo Fisher MA190582);在柠檬酸缓冲液中(代码AR9961, Leica Biosystems)，在100°下对anti-CD20 (1:200, Abcam, ab194970)， anti-CD31 (1:30, Abcam ab28364)， HLA-DR (1:400, Thermo Fisher MA532232;)， anti-CD163 (1:400, Thermo Fisher PA578961)(附加文件1:表S1)。所有样品用山萝卜过氧化物酶聚合物孵育15分钟，随后用3,3-二氨基联苯胺(DAB)作为棕色显色剂(Bond polymer refine detection, Leica Biosystems, Ref DS9800)显像10分钟。按照这些步骤，样品用苏木精反染5分钟，脱水，装在Pertex (Sakura)上。
用数字切片扫描仪(Pannoramic P1000/全景250,3DHistech Ltd，布达佩斯，匈牙利)对染色的切片进行数字化处理。所有分析均由两名独立观察员(JH, JR)使用数字幻灯片查看器(caseViewer, 3DHISTECH, Budapest, Hungary)进行，对治疗和随访时间不知情。根据先前介绍的4级分级系统进行定性光显微分析(附加文件1:表S2)。特定染色细胞类型和可溶性因子的存在分为0=无，1=轻度，2=中度，3=重度(附加文件1:图1)。S1和S2)。对预定义的roi进行评估:(1)动脉瘤颈部，(2)动脉瘤穹窿，(3)血栓，(4)新生内膜和(5)邻近血管(附加文件1:图S3)。如果不是所有五个ROI都在组织学玻片上被确定，则缺失的一个不针对该特定因素和ROI进行分级。所有随访时间相同的标本合并进行roi特异性分析。roi被巩固(颈部和穹顶;血栓和新生内膜)的时间依赖性分析。
Kruskal-Wallis检验比较不同roi间炎症细胞及标志物的存在情况，Mann-Whitney检验比较两组间的差异。为了评估手术特征(正态分布，参数值)，使用学生t检验。使用GraphPad Prism 8 (Version 8.2.0.435, GraphPad software, San Diego, CA, USA)对数据进行分析和可视化。数值表示为平均值±标准差(SD)(参数值)或中位数和四分位数范围(非参数值)。p值< 0.05认为有统计学意义。
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总体而言，卷曲动脉瘤显示出血栓组织和新内膜形成的增强模式，而未经治疗的动脉瘤显示出血栓形成、血栓再管化和动脉瘤生长的异质性模式(p < 0.001，图2)。7天后，与对照组相比，卷曲动脉瘤的新内膜形成明显更早(p=0.020，图3)。在生殖和长期(21天)队列中，良好的愈合状态得到了证实。经过21天的线圈治疗，n=7/8个动脉瘤完全愈合(肉眼观察)，只有n=1/8个动脉瘤在颈部有小面积残留灌注。两个治疗组的手术特征没有相关差异(附加文件1:图S4)。
动脉瘤治疗前后动脉瘤愈合的进展。动脉瘤复合体的纵向切割遵循自然过程(上排)和线圈(*)治疗(下排)，3天(A, C)， 7天(B, D)和21天(E)进入愈合过程。注意动脉瘤壁上没有细胞。线圈治疗3天后(C)，动脉瘤囊内早期血肿(H)与邻近血管管腔(AV)之间已经形成一层小的组织层，早期血肿逐渐转化(D)为成熟血栓(T)， 3周后，动脉瘤囊顶部仅残留少量血肿(E)。在没有线圈治疗的情况下，动脉瘤内血肿显示大量中性粒细胞侵袭。血栓未完全成熟和中心残留动脉瘤灌注(B)
动脉瘤愈合反映新内膜形成作为治疗(盘绕)和时间的函数。术后3天，动脉瘤卷曲和未卷曲之间无相关差异。然而，7天后，线圈治疗组的新生内膜形成明显增强。在复制队列(FU 7天)和长期队列(FU 21天)中，证实了良好的动脉瘤愈合，反映为强烈的新生内膜形成。*p < 0.05
光镜下显示，与螺旋状动脉瘤相比，未经治疗的动脉瘤明显早期存在炎症细胞(第3天)(附加文件1:图5)。然而，愈合7天后，所有检测的体液炎症标志物(TNF-α， il - 6, MMP-2, MMP-9和FGF)在卷曲动脉瘤中明显升高(附加文件1:图S6)。炎症细胞(即中性粒细胞)的分布在第7天线圈治疗和自然愈合过程中相似(p=0.98)。
在卷状动脉瘤中，体液炎症标志物逐渐增加，并在第7天达到峰值(图4)。它们在所有roi中普遍存在，但在动脉瘤囊和早期新生内膜中的浓度明显高于动脉瘤壁(TNF-α、MMP2和MMP9的浓度p < 0.0001;il - 6的p=0.001)。动脉瘤壁的颈部和穹窿之间没有差异(表1)。血管内皮生长因子浓度在所有roi的前7天保持较低，但之后上升，主要在血栓和动脉瘤壁。
及时演变的体液和细胞炎症和动脉瘤线圈治疗后愈合。柱状图显示了体液炎症(图A和B)和细胞炎症(图C和D)的中位数和四分位数范围。不同动物随时间的横断面数据表明，大多数因素的体液性炎症在第7天达到峰值——主要在血栓和新内膜中，在动脉瘤壁中也有较小程度的炎症(图a和B)。在细胞水平上(图C和D)，炎症细胞积聚在血栓中，但不在动脉瘤壁中。延迟(第7天之后)VEGF的增加与内皮化(cd31)的增加相对应，从而随着时间的推移完全愈合(p=0.01)。*p < 0.05
炎症细胞倾向于在血栓和新内膜内积聚，但较少在动脉瘤壁(既不在颈部，也不在穹顶)或邻近血管壁积聚(p < 0.001)(表2)。炎症细胞浓度上升至第7天，并保持在较高水平(图4,C/D面板)。内皮细胞在较晚的时间点(第7天之后)直接聚集在新生内膜中(p < 0.0001)。它们的存在与螺旋状动脉瘤的完全愈合有关。
定义roi的因子分布显示了以下四种不同的模式(图5):(1)大多数因子(MMP2、MMP9、FGF)和细胞类型(CD3、CD163、HLA-DR)在新生内膜>血栓>动脉瘤壁/邻近血管中积聚;(2)其他因子(TNF-α、il - 6)在血栓和新生内膜内同样高;动脉瘤壁和邻近血管较低;(3)血栓中B细胞(CD20)的积累高于新生内膜;(4)内皮细胞标志物CD 31在未受影响的相邻(健康)血管壁和成熟的新生内膜中均有发现，但在血栓或动脉瘤壁中没有发现。根据治疗、随访时间和ROI检查的每种因子和细胞类型的详细分布见附加文件1:图1。S7-S18。
正在愈合的动脉瘤的地形模式示意图。总体而言,大部分因素(例如,MMP2、MMP9 FGF)和细胞类型(CD3, CD163 HLA-DR)显示最高的积累neointima其次是血栓舱,但可忽略不计的动脉瘤壁和邻近的血管(A)。一些因子白细胞介素6 (TNF -α)均匀分布在neointima时期和血栓(B)。B细胞的积累在血栓(CD20)高于neointima和几乎没有B细胞被发现在邻近的血管壁(C)。最后,内皮细胞直接在新生内膜内积聚，它们的存在与动脉瘤的完全愈合有关
局部炎症在EVT后动脉瘤愈合中起着至关重要的作用。动脉瘤壁在这一生物学过程中没有明显的作用。相比之下，体液性炎症细胞和标志物在血栓内的第7天达到峰值，在早期新内膜中更是如此。血管内皮生长因子在愈合7天后逐渐释放。同时，表达cd31的内皮细胞从邻近血管沿新生内膜形成连续的细胞层，这与动脉瘤完全愈合有关。
先前的研究表明，动脉瘤壁细胞的稀少会导致慢性壁面炎症反应，从而引发动脉瘤进一步生长和破裂[4,9]。例如，研究发现，与未破裂的人脑动脉瘤相比，m1巨噬细胞和肥大细胞在破裂的人脑动脉瘤壁上明显过表达[15]。除了M1/ m2 -巨噬细胞失衡外，壁白细胞浸润、平滑肌细胞的表型调节和损失、内皮功能障碍和细胞死亡也与动脉瘤的形成和破裂有关[16]。然而，在血管内治疗的动脉瘤中，血栓和新内膜是相同趋化因子和细胞类型聚集的主要部位。然而，这些介质激活该部位的不同通路，促进血栓形成、平滑肌细胞侵袭、肌成纤维细胞向分泌型和收缩型分化以及新内皮化新内膜的形成[8]。动脉瘤口的内皮化对于动脉瘤的完全愈合至关重要，在兔模型中，SDF-1α已被证明可以增强内皮祖细胞的迁移，从而促进动脉瘤的完全愈合[17]。另一项关于猪实验性动脉瘤的组织学和分子愈合的研究发现，第3天血栓中有白细胞和巨噬细胞浸润，第7-14天肌成纤维细胞浸润。巨噬细胞的存在似乎对血栓形成至关重要[18]。在遗传学方面，Aoki等研究发现大鼠实验性动脉瘤壁上与炎症、细胞外基质重塑和细胞凋亡相关的基因受到动态调控，且这些动脉瘤的内膜和介质之间的基因表达谱存在显著差异[19]。此外，一项对兔模型线圈栓塞后实验性动脉瘤颈部和穹顶之间基因表达的研究发现，编码蛋白酶、粘附分子和化学引诱剂(但不包括结构分子，如胶原蛋白)的基因过表达与良好愈合有关[20]。炎症因子的双重和相反的作用——破坏或刺激取决于动脉瘤复合体的位置——也在另一项关于破裂和未破裂的人类动脉瘤的研究中被报道。作者发现血管内皮生长因子受体在动脉瘤眼底的表达与壁T细胞和巨噬细胞浸润以及管腔血栓形成增强有关[21]。
对于不同的EVT，有趣的是，炎症因子的表达在传统线圈栓塞和血流分流器(FD)治疗之间存在很大差异。具体而言，在实验性兔动脉瘤中，与FD治疗相比，在盘绕动脉瘤中发现与伤口愈合相关的分子的频率高出4倍[22]。这表明，动脉瘤盘绕后的愈合主要依赖于动脉瘤内血栓组织，而FD后的愈合更依赖于内皮细胞沿支架的直接增殖，这些细胞主要来自载动脉(以及可能循环的祖细胞)[1,2]。此外，与卷状动脉瘤相比，FD治疗中与炎症相关的基因(TNF-α，单核细胞化学引诱蛋白1)表达上调，而蛋白酶(MMP 2和9)和结构蛋白(胶原和纤维连接蛋白)表达水平较低[23]。然而，伴随线圈的FD手术导致活性MMP 9水平下降，作者得出结论，动脉瘤内血栓是MMP激活的部位，在线圈的存在下MMP激活减少[6]。
动脉瘤盘绕后的愈合是一个动态的过程。已经提出了许多不同的策略来增强生物愈合阶段，使用靶向动脉瘤壁的药物或提供全身作用模式(如阿司匹林)[24]。然而，鉴于上述发现，动脉瘤内腔将是一个有希望的位置，以管理药用活性物质。例如，含有IL-6或骨桥蛋白的线圈涂层已被证明可以正向调节单核细胞趋化蛋白1，并在小鼠模型中与良好的动脉瘤愈合有关[25]。携带生长因子的线圈，如FGF、组织生长因子β (TGF-β)、VEGF等[26,27]，或组织同种异体移植物(成纤维细胞、干细胞)[28,29]，在临床前实验中也显示出有希望的结果，但尚未在人体中进行测试。涂层其他血管内装置，如WEB装置、支架或FD，可以通过更精确地将药物物质输送到新内膜形成的部位来增加潜在的效果。
本研究揭示了EVT后动脉瘤愈合过程中炎症因子的明显地形分布以及及时演变。结果非常可靠，得到了长期队列研究的证实，并得到了复制队列研究的内部验证。然而，动脉瘤壁重塑和血栓形成并不完全由局部炎症决定。例如，受动脉瘤大小和动脉瘤母动脉形态影响的血流特性可能起重要作用。通过使用具有高度标准化动脉瘤尺寸的动脉瘤模型，这种影响被最小化。尽管在实验动物之间个体间的尺寸差异很小，但这不太可能产生可察觉的影响。然而，所选择的动脉瘤模型既不能反映人颅内动脉瘤的发病机制，也不能反映EVT后生物动脉瘤愈合的各个方面。由于动脉瘤壁在这一过程中起着重要作用，因此使用一种允许高度退化、脱细胞壁条件导致动脉瘤重塑、生长并最终破裂的模型至关重要[8,30,31]。此外，性激素也被证明对动脉瘤愈合过程有显著影响[32]。为了避免这种潜在的混淆因素，本研究仅使用雄性大鼠。最后，由于动脉瘤形成手术可能引发炎症，因此必须考虑实验组的炎症相对于对照组(自然过程)。
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