为了评价壳聚糖对不同初始成分的红葡萄酒的应用效果，采用壳聚糖对单宁/花青素比(T/A)在0.15 ~ 2.44之间的4种葡萄酒进行处理。由于氧化是影响葡萄酒陈酿的主要因素之一，因此对所有样品都进行了强制氧化测试。壳聚糖的加入决定了总酚类化合物的减少，主要是由于蛋白质反应性单宁的吸附，从初始值的10%下降到50%。之前添加的壳聚糖在氧化后测定了较低的乙醛产量，证实了这种氨基多糖的抗氧化活性。在T/ a比较高的样品中，乙醛的产量较低，这可能是由于乙醛与黄烷醇和花青素反应产生聚合色素。这些结果表明，在T/ a比较高的红酒中使用壳聚糖可能会降低对蛋白质起反应的单宁含量，并起到抗氧化剂的作用。
壳聚糖是一种生物衍生物，由几丁质(n -乙酰-d氨基葡萄糖组成的多糖)在碱性环境下部分去乙酰化而得到[1]。它可以从昆虫、甲壳类动物的外壳、真菌和植物的细胞壁等由外骨骼组成的生物体中获得[2]。
目前，在葡萄酒行业中，壳聚糖因其对多种微生物的抑菌活性而受到广泛关注[3]。结果表明，壳聚糖作为酵母[4,5]和细菌[6,7]的生长抑制剂也具有活性。此外，据Chinnici等人[8]报道，壳聚糖对葡萄酒中的金属具有螯合活性，这可能证明了其抗氧化活性[9]。国际葡萄和葡萄酒组织的国际葡萄酒和烈酒分析方法纲要[10]承认其作为细化剂用于降低浊度和防止蛋白质雾霾;目前，壳聚糖在葡萄酒中的添加限量为10 ~ 500 g/h L[11]。
根据上面强调的不同应用，它在葡萄酒工业中的使用有所增加，但关于壳聚糖与红葡萄酒中酚类化合物相互作用的研究仍然很少[12,13]。
酚类化合物是葡萄酒长寿的原因[14,15]，也是生产高品质葡萄酒的基础[16,17]。在红酒中的酚类化合物中，最重要的一类是花青素和单宁。花青素影响葡萄酒的颜色[18,19]，而单宁则影响主要的触觉如涩味和味觉如苦味[20]。
不同的研究[21,22]报道，在红葡萄酒的陈酿过程中，酚类成分对延长葡萄酒的保质期起着重要的作用。因此，花青素和单宁之间的比例会影响葡萄酒的稳定反应和适当的陈酿[23,24]。最近的研究强调了壳聚糖与酚类化合物[25]的相互作用，主要是与单宁和聚合色素[13,26]的相互作用，但对不同初始成分的红葡萄酒的影响尚不清楚。
本研究旨在评价壳聚糖对四种不同T/A比的红酒强制氧化前后酚类组分和乙醛含量变化的影响。
实验计划是在意大利南部生产的一种红葡萄酒上进行的。在制备实验样品之前，对酒进行分析，得到表1所示的主要基础参数。
将葡萄酒分成4 × 2个实验样品，每个实验地块处理4种不同T/A比的葡萄酒。
为了获得不同的T/A比，我们添加了不同数量的浓缩单宁(VR Grape Laffort Oenologie，波尔多，法国)。Harbertson等人报道了添加单宁的化学特性[27]。为了得到不同的T/A比，加入以下浓缩单宁量:600 mg/L得到样品(WT0.5)， 1200 mg/L得到样品(WT1)， 2400 mg/L得到样品(WT2)。因此，得到了四种不同T/A比的葡萄酒(表2):W样品(对照酒T/A比0.15)，w0.5样品(T/A比0.48)，W1样品(T/A比1.24)和W2样品(T/A比2.44)。为评价壳聚糖对各实验酒的影响，分别加入500 mg/L的壳聚糖(C) (Sigma-Aldrich CAS: 9012-764)。添加壳聚糖后，进一步制得不同T/A比的4种葡萄酒:W-C (T/A比为0.15时)、WT0.5C (T/A比为0.48时)、WT1-C (T/A比为1.24时)和WT2-C (T/A比为2.44时)。
所有样品过滤(0.45微米)，保存在18°C的温度下，7天后分析，以评估细化效果。所有的葡萄酒都被先后处理，以评估他们的葡萄酒氧化反应，如下一段所述。
Coppola等人[28]报道了葡萄酒氧化反应的评价。实验在控制温度18℃下进行，每个样品加入19 mg/L H2O2(相当于18 mg/L O2) (30% Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH Steinheim, France)处理。
过氧化氢(o)的加入引发氧化，相应的氧化实验样品命名为:“Wo”(对照酒T/A比0.15加入H2O2)、“W Co”(对照酒T/A比0.15加入壳聚糖和H2O2)、“WTo 0.5”(T/A比0.48加入H2O2)、“WTo 1”(T/A比1.24加入H2O2)、“WTo 2”(T/A比2.44加入H2O2)。将含有壳聚糖的样品分别命名为“W Co”(对照酒T/A比0.15，壳聚糖和H2O2添加)、“wto - c0.5”(T/A比0.48，壳聚糖和H2O2添加)、“wto - c1”(T/A比1.24，壳聚糖和H2O2添加)和“wto - c2”(T/A比2.44，壳聚糖和H2O2添加)。处理15天后的样品离心，过滤(0.45微米)，然后分析。所有的样品都是一式两份。
乙醛的分析采用Han等人描述的高效液相色谱分析[29]。样品在玻璃小瓶中进行衍生化:加入新配制的二氧化硫溶液(1120 mg/L)(20μL)，然后用硫酸(卡洛尔巴试剂96%)(25%)(20μL)酸化样品。然后加入衍生化试剂(140μL) 2,4-二硝基苯肼(Aldrich化学)(2g /L)和酒样等分液(100μL)。
混合后，溶液在65℃下反应15分钟，然后在室温下冷却。采用HPLC SHIMADZULC10 ADVP仪器(Shimadzu Italy, Milan)进行分析，该仪器由一个系统控制器SCL-10AVP、两个泵LC-10ADVP、一个检测器SPD-M 10AVP、自动进样器SIL-20HTA和一个Waters Spherisorb柱(250 × 4.6 mm, 4 μm粒径)组成。
色谱条件:进样量50μL;流量:0.75 mL/min;柱温，35℃;流动相溶剂，(A) 0.5%甲酸(Sigma-Aldrich 95%)溶于水ml - q (Sigma-Aldrich)和(B)乙腈(Sigma-Aldrich 99.9%)。使用以下梯度洗脱方案:35% B至60% B (t=8分钟)，60% B至90% B (t=13分钟)，90% B至95% B (t=15分钟，保持2分钟)，95% B至35% B (t=17分钟，保持4分钟)，总运行时间为21分钟。使用衍生乙醛标准进行校准。所有分析均通过两个实验副本和两个分析副本进行。
采用高效液相色谱法对天然花青素和聚合酚类物质进行了分析，所用仪器与上述相同。
酚类化合物的分离方法参照Waterhouse等[30]。样品经0.45微米Durapore膜过滤器(Millipore-Ireland)过滤后，装入玻璃小瓶，注入色谱柱(Agilent PLRP-S 100-?反相聚苯乙烯二乙烯基苯柱4.6 × 150 mm, 3μm粒径，用相同包装材料PLRP-S, 5 × 3mm的保护筒保护)。通过监测520 nm处的吸光度信号进行检测。
色谱条件:进样量，20μL;流量:1 mL/min;柱温，35℃;溶剂A, 1.5% v/v正磷酸(EMP Chemicals, Gibbstown, NJ, USA)和溶剂B, 80%乙腈(HPLC级，Honeywell, Muskegon, MI, USA)和20%溶剂A。
使用的梯度为:零时间条件下，B 6%;73分钟，B 31%;78 min, B 62%，保持不变至86 min;90分钟，B 6%。在注入下一个样品之前，这个零时间溶剂混合物之后是15分钟的平衡期。
校准曲线采用增加注射量的malvidin-3-单葡糖苷(Extrasynthese, Lyon, France)，浓度以mg/L的malvidin-3单葡糖苷表示。
所有分析均通过两个实验副本和两个分析副本进行。
用Jenway 7305分光光度计测定其色度特性和光度测定。颜色强度(abs420 nm + abs520 nm + abs620 nm)和色相(abs420 nm/ abs520 nm)的分析由Glories报道[31]。单宁对BSA的反应性采用harberson - adams法测定[32]，香兰素反应性黄烷(VRF)采用Di Stefano和Guidoni先前报道的方法测定[33]。
31)。单宁对BSA的反应性采用harberson - adams法测定[32]，香兰素反应性黄烷(VRF)采用Di Stefano和Guidoni先前报道的方法测定[33]。
?E的评价是使用配备0.5 cm电池的NomaSense Color P100对CIELAB参数(L?，a?，b?)进行分析，色差计算为国际照明委员会(CIE)报告的L?，a?和b?定义的三维空间中两点之间的欧几里得距离[34]。
所有分析均通过两个实验副本和两个分析副本进行。
使用XLSTAT (Addinsoft软件，2017.1)进行统计分析。采用方差分析(ANOVA)评价处理的影响，采用Tukey’s法评价显著性差异(p < 0.05)。所有数据均为四个值的平均值:两个实验副本和两个分析副本。
摘要
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结果与讨论
结论
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壳聚糖处理前后不同T/A比的葡萄酒对比如图1所示。正如预期的那样，正如之前报道的那样，随着T/A比的增加，葡萄酒中总酚、香兰素活性黄烷和单宁对牛血清白蛋白的反应浓度增加[24]。壳聚糖的加入使样品W-C和WT2-C中总酚类化合物略有下降。只有样品W对香兰素活性黄烷有显著影响。
壳聚糖对总酚(A)、香兰素活性黄烷(B)、单宁对牛血清白蛋白(C)和总花青素(D)的影响。根据Tukey (HSD)的分析，不同的字母表示处理过的葡萄酒有统计学上的显著差异(p < 0.05)。T/A比对葡萄酒W、WT 0.5、WT 1和WT 2 (A - c)的影响用大写字母表示，壳聚糖添加对葡萄酒W- c、WT 0.5- c、WT 1- c和WT 2- c (A、b、c)的影响用小写字母表示。星号(*)表示每种葡萄酒经过壳聚糖处理前后的统计差异。所有数据均以均数±标准差表示
相反，与先前的研究一致[12,13]，壳聚糖的添加影响bsa -活性单宁的浓度。样品河北本科分数线W的下降幅度较大(- 50%)，样品WT2的下降幅度较小(- 10%)。WT2样品中bsa活性单宁的吸附量最大，为102.21 mg/L。据Harbertson等人[35]报道，bsa反应性单宁并不涉及葡萄酒中存在的所有单宁，而只涉及高分子量单宁。作者表明，通过测定BSA沉淀的单宁得到的参数受到单宁聚合度的影响，并随着聚合度(或大小)从三聚体(10%)增加到八聚体(93%)而增加[36]。因此，这些数据表明壳聚糖对高分子量单宁具有更强的反应性，这是由壳聚糖与BSA的相互作用决定的。如图1所示，所有样品中总花青素的浓度都在300 mg/L左右，壳聚糖处理的样品中总花青素的含量略低。
总单体花青素和聚合色素的比较见表3。随着T/A比的降低，天然花青素呈比例减少。可能，大量的低聚单宁促进了涉及游离单体花青素的新色素形成的反应[37]。壳聚糖处理后的样品中总花青素的含量有所下降，但天然花青素的参与可以忽略不计，仅在样品W和WT1中观察到处理后的样品与未处理的样品之间的差异。这可能是由于这些单体色素在壳聚糖上的轻微吸附，如Ribeiro等人先前报道的[38]。
聚合色素对壳聚糖的反应性与T/A比的变化相关(表3)。在对这些色素化学性质的评估中，Peng等人报道的低聚物(5个单位或更高)占很大比例[39]。关于壳聚糖与红酒中酚类化合物的反应能力，数据证实壳聚糖与多聚酚类化合物反应强烈。
正如预期的那样，低聚单宁的加入对颜色强度产生了积极的影响(表4)。然而，同时观察到色调的轻微增加可能是由于单宁对黄色色调的影响[40]。武汉职业技术学院2021分数线
与文献[41]一致，壳聚糖处理对除WT0.5外的每个样品的颜色强度都有负面影响。由于壳聚糖测定了所有样品中聚合色素的减少(表2)，很可能聚合色素的减少影响了处理过的葡萄酒的颜色强度。
此外，计算壳聚糖处理前后的?E评价(表5)。每一种加入单宁并经壳聚糖处理的葡萄酒，?E的变化均大于两点。与Pérez-Magari?o等人的观点一致[42]，很明显，细化处理在WT 0.5时产生了人眼可见的颜色变化。
在我们的实验中，壳聚糖的添加对精制后的葡萄酒中乙醛的浓度没有影响。即使初始T/A比也会轻微影响乙醛浓度(表6)，仅在用高浓度浓缩单宁(WT1)处理的样品中显示出统计上较高的值，这可能是由于儿茶酚的增加，儿茶酚可以氧化为影响芬顿反应和乙醛生成的醌[15,43]。
Casellato等[44]和Singleton[45]的研究表明，氧化应激后，乙醛的含量增加。氧化后，处理过的葡萄酒在乙醛方面表现出有趣的差异(表6)。在T/ a比较高的样品中[24]，添加了壳聚糖，其浓度较低。可能，最高浓度的单宁促进了乙醛参与聚合反应[46]，而壳聚糖的积极作用是由于这种聚合物的直接自由基清除活性[47]。酚类化合物之间的比较在图2中报道，总酚和香兰素活性黄烷受到细化而不受氧化的影响。单宁对牛血清白蛋白的反应显著增加，这可能是由于氧化应激增强了单宁聚合[35]。相反，正如预期的那样，总花青素的减少发生了。
氧化对总酚(A)、香兰素活性黄烷(B)、单宁对牛血清白蛋白(C)和总花青素(D)的影响。根据Tukey (HSD)的分析，不同的字母表示处理过的葡萄酒有统计学上的显著差异(p < 0.05)。T/A比对Wo、WTo 0.5、WTo 1和WTo 2葡萄酒的影响用大写字母表示(A - d)，壳聚糖添加对W-Co、WT 0.5- co、WT 1- co和WT 2- co葡萄酒的影响用小写字母表示(A、b、c、d)。星号(*)表示每种葡萄酒经过壳聚糖处理前后的统计差异。如果该值显著高于未氧化样品，则使用希腊符号(α)，如果该值显著低于未氧化样品，则使用符号(β)(图1)。所有数据均以平均值±标准差表示
壳聚糖的添加对酚类化合物的浓度产生了负面影响，特别是对BSA反应的总花青素和单宁的影响与文献一致[12,36]。氧化后，香兰素活性黄酮仅在样品WTo 2中有统计学差异。表7显示了单体花青素和色素聚合物的浓度。正如预期的那样，T/A比的增加导致聚合颜料的比例增加;同时，天然花青素的数量急剧减少，可能是由于单体色素参与了聚合反应[22]。这些数据证实了先前报道的乙醛参与新聚合色素形成的假设。即使在氧化后，壳聚糖的加入也导致了所有实验样品中聚合度最高的化合物(bsa -活性单宁和聚合色素)的减少。
观察到的色素差异影响颜色强度、色调和?E(表8和表9)。较低的T/A比能更好地保留颜色强度，而增加T/A比能略微提高色调。氧化胁迫前添加壳聚糖对葡萄酒的颜色强度和色调有负面影响，这可能是由于花青素和聚合色素的变化影响了葡萄酒的色度。表9中?E的分析证实，在高T/ a比和壳聚糖处理的样品中，颜色特征的变化很明显(?E > 3)。
本研究评价了氧化前后添加壳聚糖对四种不同T/A比红酒的影响。我们的结果证实，壳聚糖的加入影响酚类化合物的浓度，特别是与高分子量单宁反应。在葡萄酒色素中，壳聚糖的添加对单体花青素的影响较小，而对聚合色素的影响较大。
此外，我们的结果证实，更高的T/A比率决定了更高的稳定颜色颜料浓度。较高的T/A比和壳聚糖的加入也决定了氧化反应产物如氧化后的乙醛的产量较低。
数据表明壳聚糖对高聚合度的化合物具有很强的反应性;因此，建议将其用于高T/ a比的葡萄酒，以避免葡萄酒过度贫化，特别是酚类化合物浓度低的葡萄酒。
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